Гибридизация-основа технологии

Основа всех современных ДНК-технологий – гибридизация. В результате гибридизации молекулы нуклеиновых кислот способны формировать устойчивые двухцепочечные структуры благодаря связям между элементами молекул - нуклеотидами. Нуклеотид аденин (А) комплиментарен тимину (Т), гуанин (Г) - цитозину (Ц). В результате одноцепочечная последовательность нуклеотидов АТГЦ будет образовывать стабильную ассоциацию, двухцепочечную структуру, с одноцепочечной молекулой ДНК состава ТАЦГ.

… АТГЦ….

| | | |

… ТАЦГ….

Подобная комплементарность приводит к «слипанию» двух молекул ДНК, одна из которых может быть неподвижно закреплена на подложке, и являться элементом ДНК-чипа. Чем больше содержится в образце молекул комплиментарных элементам чипа, тем больше их будет связываться с чипом, и тем выше будет интенсивность сигнала, воспринимаемого от данного элемента. На рис. 9 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А

) с тимином (Т

) и гуанина (G

) с цитозином (С

) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G

, предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 420=1.09х1012 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ [5].

Рис. 9.

Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе.Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А

с Т

и G

с С

. Присутствие некомплементарной пары, например G-G

, предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным [5].

Используемые для определения параметров гибридизации устройства позволяют регистрировать не только конечный результат, но и кинетику ассоциации и диссоциации комплементарных цепей. Эти технологии, делая возможным многопараметрический анализ образцов, могут предоставлять большое количество информации. Результаты гибридизации зависят от длины ДНК - пробы, химического состава меченой ДНК - мишени, температуры, при которой проводится гибридизация, состава гибридизационной смеси, типа флуоресцентной метки. Здесь необходимо отметить, что в ДНК-чипах в основном используется пассивная гибридизация, т.е. взаимодействие ДНК-мишени с иммобилизованной пробой является вероятностным процессом и зависит от различных условий.


Структура, номенклатура и биосинтез эйкозаноидов
Хотя субстраты для синтеза эйкозаноидов имеют довольно простую структуру (полистовые жирные кислоты), из них образуется большая и разнообразная группа веществ. Наиболее распространены в организме человека простагландины, которые впервые были выделены из предстательной железы, откуда и получили свое название. Позже было показано, что и д ...

Поступление и превращение азота в растениях. Поглощение азота растением
Формы азота, используемые растением. Азот входит в состав важнейшей части живого организма, а именно в состав запасных белков и белков цитоплазмы. В составе золы азота нет, так как при сжигании растений он образует газообразные окислы. В сухом веществе растения содержится в среднем 1,5% азота. Добывание азота представляет для растения н ...

Жизнь в палеозойской эре
Дальнейшее развитие органического мира схематично отображено в приложении 1. Рассмотрим лишь наиболее значительные этапы развития жизни. К середине кембрия продуктивность и биологическое разнообразие достигают такого уровня, что у экосистем возникает нужда в специализированных хищниках-макрофагах. Первыми эволюционного успеха добились ч ...