Материалы » Активность основных карбоксипептидаз при действии нейролептиков » Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н

Методы исследования. Метод определения активности карбоксипептидазы Н

Активность КП Н определяли модифицированным методом Fricker L.D. и Snyder S.H. [148].

Для определения активности фермента к 150 мкл (в случае опытной пробы) или 140 мкл (в случае контрольной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), добавляли 50 мкл гомогената ткани. В контрольные пробы, кроме того, добавляли 10 мкл 25 мкМ водного раствора ГЭМЯК. Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37°С 210 мкМ дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты.

Для экстракции продукта реакции – дансил-фен-ала – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 сек. Для разделения фаз пробы центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при lex=360 нм и lem=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность КП Н определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.


Сферосомы
Это мембранные пузырьки, встречающиеся в клетках растений, они окрашиваются липофильными красителями, имеют высокий коэффициент преломления и поэтому хорошо видны в световой микроскоп. Сферосомы образуются из элементов эндоплазматического ретикулума. На конце цистерны ЭР начинает накапливаться осмиофильный материал, затем от этого участ ...

Местоположение и функции озонового слоя
В воздухе всегда присутствует озон, концентрация которого у земной поверхности составляет в среднем 10-6 %. Озон образуется в верхних слоях атмосферы из атомарного кислорода в результате химической реакции под влиянием солнечной радиации, вызывающей диссоциацию молекул кислорода. Озоновый «экран» расположен в стратосфере, на высотах от ...

Гомеостаз
Этот термин впервые был применен американским физиологом Кэнноном, который писал: "Координированные физиологические процессы, которые поддерживают большую часть устойчивых состояний в организме, так сложны и настолько специфичны для живых существ, поскольку могут включать совместную работу головного мозга и нервов, сердца, легких, ...