Материалы » Искусственный синтез олигонуклеотидов » Воспроизведение «значащей» части гена по известной иРНК

Воспроизведение «значащей» части гена по известной иРНК

Предположим, что мы располагаем достаточным количеством нашей индивидуальной иРНК. Рассмотрим последовательность операций, позволяющую произвести метаморфозу этой иРНК в соответствующую ей часть гена прямо в пробирке.

Нам известно, что иРНК животного происхождения на своем 3'-конце несет длинный «хвост» адениновых нуклеотидов (поли А).

1 этап. Добавим к раствору нашей иРНК в достаточном количестве олигонуклеотид длиной в десяток-другой дезоксириботи-мидинов (олиго дТ). Мы уже знаем, как его можно синтезировать. Олиго дТ может гибридизоваться с поли А. Создадим для этого оптимальные условия (буфер, концентрация соли, умеренно повышенная температура). Мы получим структуру, с которой начнется 2-й этап.

2 этап. Добавим в раствор нам еще не встречавшийся фермент — «обратную транскриптазу». В присутствии 4-х дезоксирибонуклеотидов этот фермент способен вести комплементарный синтез ДНК по матрице РНК в нормальном направлении от 3' к 5'-концу матрицы. Он тоже нуждается в праймере, каковым для него послужит уже сидящий на 3'-конце иРНК олиго дТ

3 этап. Обработаем полученный РНК-ДНК гибрид упомянутой ранее рибонуклеазой Н. Она как раз разрушает РНК, находящуюся в двунитевом гибридном комплексе с ДНК (см. там же). Однако поставим этот фермент в такие условия, чтобы наша иРНК была разрушена не до конца — остались небольшие ее участки.

4 этап. От этих участков, как от праймеров, начнет работать вносимая на этом этапе ДНК-полимераза I. Она, как нам известно, не только ведет матричный синтез ДНК, но и обладает S'-S* экзо-нуклеазной активностью. Благодаря этому она разрушает остатки иРНК и образует из синтезированных ею фрагментов, не без помощи все той же ДНК-лигазы, полноценную нить ДНК.

Полученную таким образом двухнитевую молекулу принято именовать «кДНК», имея в виду, что она является комплементарно выстроенным отображением исходной иРНК. Эта ДНК соответствует значащей последовательности нашего гена, поскольку все интроны (повторю это еще раз) были «вырезаны» уже при выходе исходной иРНК из ядра в цитоплазму. РНК-полимераза бактерии, которой придется транскрибировать плазмидную ДНК, на участке этой встроенной кДНК произведет полноценную иРНК для синтеза интересующего нас белка.


Гены - модификаторы. Пример и схема
Гены - модификаторы – не имеют собственного влияния на признак, однако изменяют действие др генов из неаллельных пар, тем самым вызывая модификаторы (изменения) простых признаков. 9:3:4 (F2).с ними связаны понятия – пенетрантности, экспрессивности. Пенетрантность – способность гена проявиться фенотипически, выражается в процентах и быв ...

Принцип корреляций (Кювье)
Ни одна часть организма (системы) не может меняться без соответствующего изменения других частей. Подтверждение основных принципов является главной за­дачей экспериментальных и теоретических исследований в об­ласти элементарных частиц. Порядок в их многообразии стал наводиться после открытия новых данных и новых типов сим­метрии, а так ...

Секвенаторы белков
Остается сказать несколько слов об еще одном автомате, предоставляющем в распоряжение исследователя необходимую для всего дальнейшего последовательность аминокислот в исходном белке. Первый вариант такого автомата был предложен еще в 1967 году Эрдманом и Беггом. Он настолько хорошо зарекомендовал себя, что в основных чертах сохранился д ...